ND KIT 100 PROBE

128,80 Lei
In stoc

Durata de livrare: 1 - 3 zile

Limita stoc
- +
Adauga in cos
Cod Produs: 82038 Ai nevoie de ajutor? 0735 036 994
  • Descriere
  • Review-uri (0)
  • Specii tinta: pasari
  • Ambalare: 100 teste

 

PREZENTARE

Setul ND – KIT reprezinta un ansamblu de componente pentru detectia si determinarea titrului anticorpilor fata de virusul bolii de Newcastle din serul sanguin de pasare, prin reactia de inhibare a hemaglutinarii (IHA) – micrometoda. Setul se utilizeaza in scop de diagnostic si pentru aprecierea statusului imunitar al efectivelor de pasari  testate.

Mai putine detalii

COMPONENTELE SETULUI

Antigen NDV liofilizat – suspensie virala, tulpina La Sota. Titrul hemaglutinant (THA) este inscris pe eticheta flaconului.

Ser pozitiv NDV, liofilizat. Titrul inhibohemaglutinant (TIHA) este inscris pe eticheta flaconului.

Ser negativ, liofilizat.

Diluant pentru rehidratarea antigenului si a serurilor martor.

Component Cantitate pentru100 probe Cantitate pentru250 probe Cantitate pentru500 probe
Antigen (liofilizat) 1 fl. x 1 ml 2 fl. x 1 ml 3 fl. x 1 ml
Ser martor pozitiv (liofilizat) 1 fl. x 1 ml 2 fl. x 1 ml 3 fl. x 1 ml
Ser martor negativ (liofilizat) 1 fl. x 1 ml 2 fl. x 1 ml 3 fl. x 1 ml
Diluant 1 fl. x 4 ml 1 fl. x 6 ml 1 fl. x 10 ml
Instructiuni de utilizare a trusei 1 ex. 1 ex. 1 ex.

 

MOD  DE LUCRU

  1. Echilibrarea termica a reagentilor

Componentele trusei se aduc la temperatura camerei (~20°C) cu cel putin 30 de minute inainte de lucru.

  1. Prepararea tamponului fosfat salin (TFS) in laborator

- Se cantaresc si se dizolva in apa distilata sau deionizata urmatoarele substante:

- clorura de sodiu (NaCl) …………………………………… 9 gr.

- fosfat disodic cu 12 molecule de apa

(Na2HPO4 x 12 H2O) ……………………………………..1,35 gr.

- fosfat monosodic cu o molecula de apa

(NaH2PO4 x H2O)…………………………………………..0,36 gr.

- apa distilata sau deionizata ……………………………..1 litru.

Se corecteaza pH-ul solutiei obtinute astfel incat sa fie cuprins intre 7,2 – 7,4. Solutia obtinuta poate fi sterilizata prin autoclavare 20 minute la 121°C. Solutia TFS sterilizata poate fi pastrata la 2 – 8°C timp indelungat.

  1. Prepararea suspensiei de hematii

Pasarile donatoare trebuie sa fie lipsite de anticorpi anti NDV; Hematiile vor fi recoltate din vena axilara in solutie Alsever;

Inainte de utilizare in test, hematiile se spala prin centrifugare si resuspendare in tampon fosfat salin TFS, de cel putin 3 ori. Centrifugarea se realizeaza la 1000 – 1200 rpm, timp de 10 – 15 minute;

Suspensia de eritrocite poate fi pastrata ca stoc, daca dupa ultima centrifugare este diluata ½ cu TFS si stocata la 2 – 8°C timp de 4 – 5 zile;

Concentratia suspensiei de hematii utilizata in test este de 1% in TFS (de exemplu: 0,5 ml suspensie hematii + 49,5 ml TFS).

  1. Verificarea componentelor setului ND – KIT

4.1. Verificarea titrului HA al antigenului

Prepararea antigenului: antigenul se prezinta sub forma unei pastile liofilizate de culoare alb-galbuie. Pastila se rehidrateaza adaugand 1 ml diluant/flacon de antigen, obtinandu-se antigenul brut. Micrometoda IHA utilizeaza 4 unitati hemaglutinante (UHA). Pentru prepararea dilutiei de lucru a antigenului (cu un titru HA ce contine 4 UHA), se imparte titrul antigenului inscris pe eticheta la 4.

De exemplu: titrul antigenului inscris pe eticheta flaconului este 256, iar titrul HA va fi 256:4 = 64. Deci, antigenul brut rehidratat va fi diluat 1:64, adica la 1 ml antigen rehidratat se vor adauga 63 ml tampon fosfat salin TFS.

(Nota: antigenul se poate prepara in cantitatea necesara pentru efectuarea testului in functie de numarul de probe, pastrand insa proportiile, de exemplu: 0,1 ml antigen rehidratat + 6,3 ml TFS).

Verificarea antigenului: se realizeaza prin tehnica de hemaglutinare directa (micrometoda):

a) intr-o placa de microreactie cu godeuri cu fundul rotund sau in forma de V se repartizeaza in primele 4 randuri orizontale (A, B, C si D) cate 25 μl TFS;

b) in primul godeu din randurile A, B si C se adauga cate 25 μl antigen brut, rehidratat si se omogenizeaza prin pipetari repetate; in aceste godeuri s-a realizat dilutia ½ a antigenului brut;

c) cu ajutorul unei pipete automate se realizeaza dilutii seriale log2 (1/4, 1/8, 1/16….1/4096), transferand cate 25 μl dintr-un godeu in urmatorul. Dupa fiecare transfer se omogenizeaza suspensia prin pipetari repetate. Dilutiile se realizeaza pana la ultimul godeu din randurile A, B si C (randul 12 vertical). Din ultimele godeuri se elimina cate 25 μl suspensie;

d) se repartizeaza cate 25 μl TFS in toate godeurile din randurile A, B, C si D;

e) in toate godeurile randurilor A, B, C si D se adauga cate 25 μl suspensie 1% hematii in TFS;

f) placa de reactie se agita usor si se lasa la temperatura camerei (~20°C) timp de 40 de minute sau la 4°C timp de 60 de minute;

g) dupa expirarea timpului alocat reactiei, in randul D (martorul de hematii) suspensia de hematii trebuie sa se depuna pe fundul godeului sub forma unui buton distinct. Titrul hemaglutinant al antigenului este dat de dilutia corespunzatoare ultimului godeu unde hematiile se afla in mod evident in suspensie (absenta butonului, ca o indicatie a hemaglutinarii). Hemaglutinarea trebuie sa fie uniforma in cel putin 2 din cele 3 randuri A, B si C.

Titrul hemaglutinant astfel determinat trebuie sa corespunda valorii inscrise pe eticheta flaconului cu antigen.

4.2. Verificarea titrului IHA pentru serul martor pozitiv

Prepararea serului martor pozitiv: Serul martor pozitiv se prezinta sub forma unei pastile liofilizate de culoare alb-galbuie. Pastila se rehidrateaza in 1 ml TFS/flacon ser martor pozitiv, obtinandu-se serul pozitiv brut, caruia i se va verifica titrul IHA. Serul brut rehidratat se va dilua conform titrului IHA inscris pe eticheta flaconului sau conform titrului rezultat in urma verificarii. De exemplu: titrul IHA inscris pe eticheta este 1/256. Serul pozitiv brut, rehidratat se va dilua 1:256, adica la 1 ml ser rehidratat se adauga 255 ml TFS.

(Nota: serul pozitiv se poate prepara si in alte cantitati, dupa necesitati, dar pastrand proportiile corespunzatoare dilutiei date de titrul IHA; de exemplu: 0,1 ml ser rehidratat + 25,5 ml TFS).

Verificarea serului martor pozitiv: se realizeaza prin tehnica de inhibare a hemaglutinarii (micrometoda):

a) intr-o placa de microreactie cu godeuri cu fundul rotund sau in forma de V se repartizeaza in primele 4 randuri orizontale (A, B, C si D) cate 25 μl TFS;

b) in primul godeu din randurile A si B se adauga cate 25 μl ser martor pozitiv brut, rehidratat si se omogenizeaza prin pipetari repetate; in aceste godeuri s-a realizat dilutia ½ a serului martor pozitiv brut;

c) cu ajutorul unei pipete automate se realizeaza dilutii seriale log2 ale serului (1/4, 1/8, 1/16….1/4096), transferand cate 25 μl dintr-un godeu in urmatorul. Dupa fiecare transfer se omogenizeaza dilutiile astfel realizate, prin pipetari repetate. Dilutiile se realizeaza pana la ultimul godeu din randurile A si B (randul 12 vertical). Din ultimele godeuri se elimina cate 25 μl suspensie;

d) in toate godeurile randurilor A, B si C se repartizeaza cate 25 μl antigen diluat corespunzator titrului inscris pe eticheta (astfel incat sa aiba 4 UHA);

e) placa de reactie se agita usor si se lasa la temperatura camerei (~20°C) timp de 30 de minute sau la 4°C timp de 60 de minute;

f) dupa expirarea timpului de reactie, in toate godeurile randurilor A, B, C si D se adauga cate 25 μl suspensie 1% hematii in TFS;

g) placa de reactie se agita usor si se lasa la temperatura camerei (~20°C) timp de 40 de minute sau la 4°C timp de 60 de minute;

h) dupa expirarea timpului alocat reactiei, in godeurile randului D (martorul de hematii) suspensia de hematii trebuie sa se depuna pe fundul godeului sub forma unui buton rosu, distinct; in godeurile randului C (martorul de antigen), hematiile trebuie sa fie in suspensie (absenta buton). In godeurile din randurile A si B, de la primul godeu pana la godeul cu dilutia corespunzatoare titrului IHA inscris pe eticheta serului, trebuie sa se observe prezenta butonilor distincti. Aceasta indica o inhibare a hemaglutinarii, datorate prezentei anticorpilor anti NDV in ser. In urmatoarele godeuri, hematiile trebuie sa fie in suspensie (absenta buton), in mod identic cu randul C (martorul de antigen).

i) Titrul inhibohemaglutinant al serului martor pozitiv este dat de reciproca dilutiei corespunzatoare ultimului godeului unde se observa in mod evident prezenta butonului de hematii (in urmatoarele godeuri hematiile fiind in suspensie). Titrul inhibohemaglutinant al serului martor pozitiv trebuie sa fie identic in cele doua randuri A si B.

Titrul inhibohemaglutinant astfel determinat trebuie sa corespunda valorii inscrise pe eticheta flaconului cu ser martor pozitiv.

4.3. Serul martor negativ

Prepararea serului martor negativ: serul martor negativ se prezinta sub forma unei pastile liofilizate de culoare alb-galbui sau galbui-roscata. Pastila se rehidrateaza in 1 ml TFS/flacon de ser martor negativ, obtinandu-se serul negativ gata de utilizare.

  1. Testarea serurilor de analizat cu setul ND – KIT

Inactivarea serurilor de testat: Serurile de testat se inactiveaza pe baie de apa, la 56°C, timp de 30 de minute. Nu se testeaza serurile hemolizate sau contaminate bacteriologic. Dupa inactivare, serurile se pot pastra 30 de zile la –20°C.

Executarea reactiei IHA:

a) cu ajutorul pipetei multicanal se repartizeaza cate 25 μl TFS in toate godeurile placii de reactie (godeuri cu fund rotund sau in V);

b) in fiecare godeu din coloana 1 se repartizeaza cate 25 μl din serurile de testat individualizate;

c) pentru fiecare ser de testat se realizeaza dilutii seriale log2, pana la coloana 10 pentru prima placa (1/2, 1/4,…1/1024) si apoi pana la ultima coloana (12) pentru urmatoarele placi (1/2, 1/4,…1/4096); se elimina cate 25μl suspensie din godeurile corespunzatoare ultimei dilutii;

d) in godeurile A, B, C si D din coloana 11 se adauga 25 μl din serul martor pozitiv rehidratat si diluat conform pct. 4.2, iar in godeurile E, F, G si H din coloana 11 se adauga 25 μl din serul martor negativ rehidratat;

e) se repartizeaza cate 25 μl din antigenul preparat in dilutia de lucru corespunzatoare titrului (4 UHA), cu exceptia godeurilor E, F, G si H din coloana 12 in care se adauga cate 25 μl TFS (aceste godeuri reprezinta martorul de hematii); pentru repartizare, se poate utiliza pipeta multicanal;

f) placa de reactie se agita usor pentru omogenizare si se incubeaza la temperatura camerei (~20°C) timp de 30 de minute sau la 4°C timp de 60 de minute;

g) dupa expirarea timpului de reactie, in toate godeurile placii de reactie se adauga cate 25 μl suspensie 1% hematii de gaina, preparata in TFS; pentru repartizare, se poate utiliza pipeta multicanal;

h) placa de reactie se agita usor pentru omogenizare si se incubeaza la temperatura camerei (~20°C) timp de 40 de minute sau la 4°C timp de 60 de minute;

Dupa expirarea timpului alocat reactiei, se interpreteaza rezultatele prin citirea reactiilor din godeurile ce contin serurile de testat si compararea lor cu reactiile din godeurile coloanelor 11 si 12, ce contin martorii pozitiv si negativ, martorul de antigen si martorul de hematii. Titrul inhibohemaglutinant este dat de reciproca ultimei dilutii a serului de testat pentru care se mai observa prezenta evidenta a butonului de hematii.

 

CONDITIILE DE VALIDARE A TESTULUI

Testul este valid daca:

- prin titrarea antigenului rehidratat se obtine o valoare de titru HA similara celei inscrisa pe eticheta flaconului

- prin titrarea serului martor pozitiv rehidratat se obtine o valoare de titru IHA similara celei inscrisa pe eticheta flaconului; se admite o variatie de ± 1 unitate logaritmica log2 fata de titrul IHA inscris pe eticheta flaconului

- serul martor negativ va da un titru mai mic de 4 (dilutie 1/4)

 

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Titrul IHA se exprima ca reciproca dilutiei unde s-a produs inhibarea hemaglutinarii 100%, deci butonul de hematii este similar ca in cazul martorului de hematii (coloana 12 E, F, G, H). In urmatorul tabel sunt redate criteriile de interpretare, aplicate conform standardelor OIE (antigen cu 4 UHA):

 

Valoare titru IHA (TIHA) TIHA ≤ 4 Negativ
TIHA =  8 Suspect
TIHA ≥ 16 Pozitiv

 

Testul trebuie interpretat pe baza anamnezei efectivului de pasari (varsta, vaccinare etc.) si poate fi repetat daca este cazul. Se recomanda ca probele cu valori TIHA = 8 clasificate ca fiind suspecte sa fie repetate. Pentru confirmare, pot fi efectuate si alte teste.

Urmatorul tabel trebuie privit ca un ghid orientativ fata de raspunsurile normale ale efectivelor controlate dupa vaccinarile anti NDV:

Nivele titru Semnificatie
1/2 – 1/4 negativ
1/8 nesemnificativ si cert non-protectie
1/16 – 1/64 (pentru cel putin 75% din probele testate) o vaccinare cu vaccin viu in apa de baut – protectie corespunzatoare
1/32 – 1/128 (pentru cel putin 75% din probele testate) o vaccinare cu vaccin viu administrat oculo-conjunctival, prin aerosoli / spray – protectie corespunzatoare
1/128 – 1/512 (pentru cel putin 75% din probele testate) 2 – 4  vaccinari cu vaccin viu – protectie corespunzatoare
1/512 – 1/2048 (pentru cel putin 75% din probele testate) - stare de imunitate inalta, datorita vaccinarilor repetate cu vaccinuri vii (mai mult de 5 vaccinari) sau revaccinari cu vaccinuri inactivatesau- la titruri mai mari decat cele obisnuite pentru lotul testat (de ex. la tineret 1/4096): suspiciune de boala.

 

MATERIALE NECESARE CARE NU SUNT FURNIZATE IN TRUSA

- pipete reglabile mono si multicanal (pentru 25 ml)

- suspensie hematii 1%

- placi de microreactie cu 96 de godeuri cu fund rotund sau in forma de V

- tampon fosfat salin pH 7,2 – 7,4

- sticlarie de laborator

- cronometru

 

OBSERVATII

Componentele setului se folosesc numai impreuna. Antigenul rehidratat se utilizeaza imediat sau poate fi pastrat la 2 – 8°C cel  mult 72 de ore. Reagentii se aduc la temperatura camerei (~20°C) inaintea executarii reactiei.

 

CONDITII DE PASTRARE

Setul ND – KIT se pastreaza la 2 – 8°C.

Valabilitate: 1 an de la data fabricarii.

Scrie un review


Suport clienti 8:30 - 17:30

0735 036 994 office@vetdepo.ro
close

Comparare

Trebuie sa mai adaugi cel putin un produs pentru a compara produse.

close

A fost adaugat in wishlist!